روش ساده SPE برای تعیین مالاکیت سبز، کریستال ویولت و سایر رنگ‌های مصنوعی در غذاهای دریایی

رنگ‌های تری‌فنیل‌متان (TPMs) گروهی از رنگ‌های سنتزی هستند که در طیف وسیعی از صنایع مورد استفاده قرار می‌گیرند. علاوه بر کاربردهای صنعتی، این ترکیبات به دلیل خواص ضدباکتریایی، ضدقارچی و ضدانگلی در صنعت آبزی‌پروری نیز به‌کار گرفته شده‌اند. هزینه پایین، کارایی بالا و دسترسی آسان از دلایل اصلی استفاده از این رنگ‌ها در پرورش آبزیان است. با این حال، به دلیل سمیت بالا و اثرات جهش‌زا (موتاژنیک) و سرطان‌زا (کارسینوژنیک)، استفاده از رنگ‌های TPM در ایالات متحده و اتحادیه اروپا ممنوع شده است.

در هر دو منطقه سیاست “تحمل صفر” (Zero-Tolerance Policy) برای این ترکیبات اعمال می‌شود و محدودیت‌های شدید شناسایی و اندازه‌گیری بقایای این رنگ‌ها در محصولات دریایی تعیین شده است:

1 میکروگرم بر کیلوگرم (µg/kg) در ایالات متحده (FDA)

2 میکروگرم بر کیلوگرم (µg/kg) در اتحادیه اروپا (EU Commission)

از آنجا که رنگ‌های والد (Parent Dyes) به‌سرعت در بدن آبزیان متابولیزه شده و متابولیت‌های لوکو (Leuco-Metabolites) تشکیل می‌دهند که در بافت‌های ماهی باقی می‌مانند، حد تشخیص برای این ترکیبات به‌صورت مجموع رنگ والد و فرم لوکو آن بیان می‌شود.

چالش‌های تحلیلی در اندازه‌گیری رنگ‌های TPM

1. ناپایداری شیمیایی رنگ‌ها

رنگ‌های تری‌فنیل‌متان (TPMs) به دلیل ناپایداری ذاتی، در طول آماده‌سازی نمونه و تحلیل دستگاهی مشکلاتی ایجاد می‌کنند:

حساسیت به واکنش‌های اکسایش-کاهش: این رنگ‌ها به‌سرعت اکسید یا احیا می‌شوند که می‌تواند منجر به تغییر ساختار آن‌ها شود.

تجزیه ناشی از نور UV: دمتیلاسیون (Demethylation) ناشی از نور فرابنفش (UV) باعث از بین رفتن ترکیبات و تغییر نتایج آنالیز می‌شود.

2. پایداری محلول‌های استاندارد تحلیلی

متابولیت‌های لوکو در محیط‌های آبی و متانولی ناپایدار هستند و حتی در دمای -20 درجه سانتی‌گراد نیز به فرم غیر-لوکو اکسید می‌شوند.

برای جلوگیری از این مشکل، محلول‌های استاندارد باید در حلال‌های آپروتیک (مانند استونیتریل) تهیه شوند.

3. محدودیت‌های روش‌های معمول در آماده‌سازی نمونه

روش‌های مرسوم برای تحلیل TPMها معمولاً طولانی و پیچیده هستند و شامل مراحل متعدد و حجم‌های زیاد حلال برای تبخیر می‌شوند.

استخراج فاز جامد (SPE) با جاذب تبادل کاتیونی قوی (SCX) روشی مؤثر برای حذف تداخلات ماتریکس است، اما مشکل دشواری شستشوی رنگ‌ها از جاذب را دارد.

بیشتر رنگ‌های TPM دارای بار مثبت دائمی هستند و برای شستشو از جاذب SCX نیاز به غلظت‌های بالای نمک (بیش از 1 مولار) دارند که به دلیل عدم فرّاریت، برای آنالیز LC-MS/MS نامناسب است.

روش پیشنهادی برای بهبود استخراج و تحلیل TPMها

این روش یک حلال شستشوی جایگزین را معرفی می‌کند که متشکل از:

متانول (MeOH)

1% تری‌اتیل‌آمین (TEA)

0.5% اسید فرمیک

در این روش، تری‌اتیل‌آمین (TEA) به‌عنوان یک آمین نوع چهارم (Quaternary Amine) بار مثبت دارد و به‌عنوان یون مخالف (Counter-Ion) برای آزادسازی رنگ‌ها از جاذب عمل می‌کند. این مکانیسم جایگزین روش‌های مبتنی بر غلظت‌های بالای نمک شده و امکان شستشوی مؤثر رنگ‌ها از جاذب SCX را فراهم می‌کند.

مزایای این روش:

عدم نیاز به مرحله تبخیر حلال

روش‌های مرسوم شامل یک مرحله تبخیر حلال برای تغلیظ نمونه هستند که ممکن است باعث از بین رفتن برخی رنگ‌ها شود. در این روش، استخراج بدون نیاز به تبخیر انجام شده و عصاره‌های استخراج شده مستقیماً برای تحلیل استفاده می‌شوند.

سازگاری کامل با LC-MS/MS

TEA دارای فرّاریت بالا و بدون اثر یون-جفتی (Ion-Pairing) روی رنگ‌ها است که امکان تحلیل مستقیم نمونه‌های SPE را در LC-MS/MS فراهم می‌کند.

استفاده از اسید آسکوربیک به‌عنوان آنتی‌اکسیدان

هیدروکسیل‌آمین (Hydroxylamine) که معمولاً به‌عنوان آنتی‌اکسیدان استفاده می‌شود، در این روش حذف شده است زیرا بار مثبت آن باعث ایجاد تداخل در فرایند استخراج می‌شود.

در عوض، اسید آسکوربیک به‌عنوان آنتی‌اکسیدان جایگزین شده است که سازگاری بیشتری با روش استخراج دارد.